許多病毒都是RNA病毒,如新型管狀病毒。上通行的檢測方法是RT-qPCR方法。這就離不開RT-qPCR mix。下面給您介紹的這款Mix值得關(guān)注,因為它可用于新guan病毒研究檢測(不用于診斷),是其中的一個重要組分。
一、用途
RNA病毒檢測試劑盒(RT-qPCR法)(英文名:ConviFlex™RT-Taq mix)用于定性檢測和分析RNA病毒和RNA分子,特別適合檢測新guan病毒等此類病毒。
二、描述:
1.該試劑盒為實時定量qPCR(RT-qPCR)RNA病毒檢測試劑盒。
2. 試劑盒由兩種組分組成:
組分1. ConviFlex™ RT-Taq Mix的凍干粉包含:MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶及dNTP。
其中MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶,來自小鼠白血病病毒(M-MuLV)并經(jīng)過基因修飾。
這里的Taq聚合酶另兼具熱啟動功能。
此Taq酶在室溫下,活性被抗體所抑制,當(dāng)溫度達到70°C以上時,才會被*激活。
在70°C 以下時,由于Taq酶沒有*活化,因此實驗不會產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物和引物二聚體。熱啟動Taq酶的使用可使PCR具有更高的特異性和靈敏度。
3. 試劑盒使用時,先用復(fù)溶緩沖液溶解凍干粉,再加入自備的RNA模板和引物。
推薦使用MB公司提供的新guan病毒的引物/探針(英文名:SARS-CoV-2 Confirm,貨號271-2100)
4. 該試劑盒適合大多數(shù)RT-qPCR體系和qPCR儀類型。關(guān)于實驗使用的jia體積、濃度、溫度和孵育時間,本文有相應(yīng)的建議,但實驗室仍可依據(jù)自己的分析要求作相應(yīng)調(diào)整。
三、產(chǎn)品特點:
1. 凍干粉為逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶的預(yù)混液,將RNA逆轉(zhuǎn)錄與qPCR擴增兩個過程合并,一步完成,減少移液次數(shù)、避免交叉污染、操作簡單,節(jié)約時間。
2. Taq酶具有70°C熱啟動功能,顯著提高試劑盒的特異性和敏感度。
3. 主要組分為凍干粉,4℃保存,儲存運輸方便,性能穩(wěn)定。
四、需用戶自己準備的試劑耗材和儀器:
1. 引物、探針(可選)
推薦MB公司提供的新guan病毒的引物/探針(英文名:SARS-CoV-2 Confirm,貨號271-2100)
2. 熒光定量PCR儀(qPCR儀)
3. 無DNase和RNase的qPCR反應(yīng)管
4. 離心機
5. 移液器及帶濾芯吸頭(不含DNase和RNase)
6. 用戶自己的樣品。
五、樣本制備說明:
1. 來自于真核細胞、原核細胞、病毒的RNA以及體外轉(zhuǎn)錄的RNA,均可用于檢測。
2. 制備的RNA必須不含RT-qPCR抑制劑,例如有機溶劑等。
3. 盡量減少RNA樣品的凍融次數(shù),同時避免RNA酶污染,以減少RNA降解的風(fēng)險。(RNA降解會極da地限制了RT-qPCR反應(yīng)的性能)
4. 樣本制備過程中,注意避免其他DNA的污染,DNA的干擾也會降低qPCR的準確性。
建議采用商品化的RNA提取試劑盒預(yù)先處理待檢物(如拭子、活檢組織、哺乳動物細胞和細菌),例如MB廠家的:
【RNA小提試劑盒】(英文名:ExtractNow™ RNA Mini Kit,貨號603-1050)
【病毒RNA提取試劑盒】
(英文名:ExtractNow™ Virus RNA Kit, 貨號611-1010/-1050/-1250)
或使用其他已建立的方法。
六、操作注意事項:
該試劑盒應(yīng)僅由經(jīng)過培訓(xùn)的實驗室人員使用。始終穿上合適的防護fu和戴一次性手套。
根據(jù)樣品類型,應(yīng)謹慎處理所有樣品。該試劑盒不含有害物質(zhì)。殘余物可以根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)丟棄。
七、操作步驟
步驟1. 凍干粉ConviFlex™RT-Taq Mix,大速離心5秒鐘,然后加入260μl復(fù)溶緩沖液2×Rehydration Buffer,室溫靜置5分鐘后,渦旋并離心5秒鐘,分裝,待用或-18℃保存。
步驟2. 每個反應(yīng)體系為20µl,其中反應(yīng)mix為15µl。
(1)依據(jù)本次試驗樣本數(shù),制備RT-qPCR的反應(yīng)mix。
1個反應(yīng)mix需要:
①ConviFlex™ RT-Taq Mix(即上面復(fù)溶的預(yù)混液)10µl,
②引物(濃度0.1 - 0.5 µM)
③探針(濃度0.1 - 0.5 µM)
④PCR級水(使每管總體積為15µl)
注:引物和探針的推薦濃度范圍是0.1-0.5 μM。
通常,引物濃度過高,會增加引物錯配和非特異RT-PCR產(chǎn)物。然而,當(dāng)RT-PCR程序運行時間較長或使用簡并引物時,則推薦引物濃度升高至1 μM。(注意:若使用簡并引物,同一RT-PCR分析中,引物之間應(yīng)具有相同的熔解溫度)
(2)將反應(yīng)mix渦旋并離心5秒鐘。
(3)每個PCR管中加入15μl反應(yīng)mix和5μl樣本(抽提后的RNA),
或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液,作為陰性對照,或5μl PCR級水作為無模板對照,或5μl陽性對照。
(4)扣緊PCR管,然后短暫離心。
(5)將PCR管放置qPCR儀上,蓋好蓋。
步驟3. 在qPCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序,
示例: 1 cycle 50 °C for 20 min
1 cycle 95 °C for 10 min
45 cycles 95 °C for 15 sec
60 °C for 1 min
(以上程序僅依據(jù)廠家經(jīng)驗,用戶可根據(jù)實際情況調(diào)整溫度和孵育時間)
步驟4. 啟動程序
八、使用注意事項:
1. 使用前應(yīng)認真閱讀說明書。
2. 來自不同批次的試劑不能混合。
3. 試劑盒內(nèi)的試劑應(yīng)始終作為一個整體溶解分裝。
4. 試劑盒應(yīng)在效期內(nèi)使用。
5. 每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個陽性對照。每次PCR至少應(yīng)設(shè)置一個陰性對照和/或一個無模板對照。如果實驗者自己抽提RNA,則可使用洗脫緩沖液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實驗室提供的對照品,例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照,對于確認結(jié)果的可靠性或用于排除故障非常有意義。
6. 建議在無RNA和DNA污染的條件下進行RT-PCR,以避免操作過程中DNA或非特異RNA的交叉污染。(MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧,英文名:PCR Clean™,貨號15-2025,預(yù)先清潔實驗環(huán)境。)
7. RNA模板濃度,應(yīng)依據(jù)提取RNA的質(zhì)量、來源、感興趣基因的相對豐度、以及是否為低拷貝基因,來調(diào)整優(yōu)化。
8. 該試劑盒建議逆轉(zhuǎn)錄步驟的溫度為50°C。但這個溫度及持續(xù)時間可根據(jù)實驗室自己的分析要求進行優(yōu)化,以增強反應(yīng)的性能。