培養(yǎng)細胞時,要避免細菌污染。如果存在細菌污染,則培養(yǎng)液一般會渾濁變黃,對細胞生長影響明顯,細胞大多在24小時死亡。在以細胞大規(guī)模培養(yǎng)為基礎(chǔ)的生物藥產(chǎn)業(yè)中,也需要進行無菌檢查。傳統(tǒng)無菌檢查是采用TSA或TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法,一般需要培養(yǎng)14天,觀察是否有菌落生長或溶液渾濁。
現(xiàn)介紹一種通過PCR進行無菌檢查的方法,當然該方法也是用于研究。即采用德國MB的細菌檢測試劑盒(Onar Bacteria Detection Kit)。它作為PCR試劑盒,針對的是細菌高度保守的16S rRNA序列,陽性產(chǎn)物片段大小為467 bp,可跑膠后在紫外燈下觀察。另包含一個內(nèi)控對照,用于檢測PCR反應(yīng)是否正常,該內(nèi)控對照條帶為140 bp。
需要注意的是,樣品在檢測前,應(yīng)在95 °C做熱滅活 5分鐘,之后每個PCR反應(yīng)是加5ul。另外,細胞培養(yǎng)液中應(yīng)不含抗生素,細胞應(yīng)在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,因為抗生素會使細菌水平保持在檢測限以下(2.4×10的3次方/ml)。另外,檢測時應(yīng)做復孔。整個反應(yīng)體系為25ul。
該試劑盒可檢測的細菌包括:假單胞菌,放線菌,大腸埃希氏菌,沙雷氏菌,卟啉單胞菌,梭菌,葡萄球菌,鏈球菌,乳桿菌,微球菌,芽孢桿菌,克雷伯菌,沙門氏菌,腸球菌,分枝桿菌,軍團菌,葡萄球菌,消化鏈球菌。它不檢測真菌、病毒和真核細胞DNA。
典型結(jié)果如下:
總之,早期篩查細胞培養(yǎng)時是否有細菌污染,可以及時采取措施,而PCR方法更為靈敏、快速和穩(wěn)定,可以根據(jù)實際情況酌情使用。
圖. 內(nèi)控對照顯示PCR反應(yīng)正常,樣本中無PCR抑制成分。460bp左右存在目的條帶,提示存在細菌污染。