支原體早發(fā)現(xiàn)于1898年,1956年Robinson等*從細胞培養(yǎng)物中分離出支原體,之后國內(nèi)外關(guān)于支原體污染細胞的報道屢見不鮮。它廣泛存在于自然界中,有100余種。
現(xiàn)在只要是做細胞培養(yǎng)并發(fā)表論文,期刊就要求一定要做支原體檢測。一般要一周測一次支原體。
支原體檢測有好幾種方法。藥典規(guī)定有培養(yǎng)法和DNA染色法。
現(xiàn)在,PCR和qPCR方法也較為常用。PCR法支原體檢測原理是針對支原體16s rRNA保守序列設(shè)計引物,只要有支原體DNA擴增片段即證明有支原體污染存在。
qPCR支原體檢測則除了引物外,還會用到探針,均熒光素標(biāo)記,從而觀察在FAM通道是否有代表支原體的擴增曲線出現(xiàn)。
qPCR屬于比較高級的方法,PCR或者其他方法屬于比較普通的方法,更多用于常規(guī)科研實驗室,PCR也可用于工業(yè)。如用于工業(yè),則PCR和qPCR均需要完成方法學(xué)驗證方案,證明符合歐洲等藥典。
支原體檢測還有其他幾種方法:
如生物化學(xué)發(fā)光法:它是通過支原體酶與特異底物反應(yīng)產(chǎn)生ATP, ATP濃度與其激發(fā)的熒光強度成線性關(guān)系。通過檢測熒光強度,從而斷定是否有支原體存在。
如細胞感應(yīng)法,即通過支原體激活HEK-Blue™-2細胞上的TLR2受體,誘發(fā)分泌堿性磷酸酶,可通過專有培養(yǎng)基變色檢測到支原體的存在。
每種方法都有自己的長處和短處,可從結(jié)果是否直觀,操作時間長短,靈敏度,檢測的支原
體種類多少,以及是檢支原體DNA還是活的支原體等方面來評價。
但對于工業(yè)放行檢測而言,迄今為止,只有具有高靈敏度的PCR法或qPCR法才用于工業(yè),如Minerva Biolabs生產(chǎn)的支原體檢測試劑盒。而其他方法都是僅能用于科研。
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