實(shí)驗(yàn)室里總會(huì)有各式各樣的細(xì)胞需要培養(yǎng)，養(yǎng)細(xì)胞的會(huì)發(fā)生一些囧事：不做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，細(xì)胞長(zhǎng)得老快了；一到做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，自家的細(xì)胞好像吃了瞌睡藥一樣，昏昏欲睡，死活長(zhǎng)不起來(lái)。

• 細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；
• 細(xì)胞變形；
• 碎片增加；
• 懸浮細(xì)胞容易成團(tuán)；
• 培養(yǎng)基提前變色；
• 鏡下發(fā)現(xiàn)有小黑點(diǎn)；

如果排除了其他試劑選擇不當(dāng)、細(xì)胞株老化、細(xì)菌污染……原因，而仍有上述一種或幾種情況，則高度提示：細(xì)胞可能出現(xiàn)了支原體污染。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生支原體污染的機(jī)率較高，會(huì)達(dá)到70%左右，常規(guī)抗生素的使用對(duì)支原體幾乎無(wú)效。

那么，支原體污染，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有什么危害呢？

 

支原體穿透真核細(xì)胞表面 大量支原體聚集在真核細(xì)胞表面（掃描電鏡照片）

細(xì)胞被支原體污染，解決方案：

方法一：確認(rèn)細(xì)胞已被支原體污染，終止試驗(yàn)，丟棄所有被污染的細(xì)胞和耗材。

重新復(fù)蘇細(xì)胞，注意選用未被污染的細(xì)胞株、血清和培養(yǎng)基，并規(guī)范操作。

方法二：對(duì)于珍貴的，樣品不可再得的細(xì)胞，或價(jià)格昂貴的種子細(xì)胞，不但無(wú)法丟棄，而且作為種子細(xì)胞，還需要**支原體污染。

此時(shí)，需選用特異性的支原體殺除劑，清除污染，保護(hù)細(xì)胞。

目前世界上有效的方法是是德國(guó)的一款生物試劑，由Minerva公司生產(chǎn)，品名Mynox®。

此試劑可在2-3小時(shí)內(nèi)將支原體主動(dòng)殺除，但對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用。特別適合細(xì)胞保種。

Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑，加入培養(yǎng)液中，可特異性地與支原體膜結(jié)合，改變膜通透性。通過此生物物理的方法，2～3小時(shí)內(nèi)，即可把細(xì)胞中的支原體殺除掉。因?yàn)榧?xì)胞膜結(jié)構(gòu)與支原體膜不同，故Mynox®不會(huì)與細(xì)胞膜結(jié)合，因此無(wú)細(xì)胞毒性。

注意：3小時(shí)后，需將此試劑洗脫，將細(xì)胞更換到新的培養(yǎng)耗材和培養(yǎng)液中，重新培養(yǎng)。

此時(shí)，不應(yīng)使用PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中支原體。由于支原體解體，故PCR結(jié)果為假性強(qiáng)陽(yáng)性。

具體操作流程見下圖：

 

Mynox®祛除貼壁細(xì)胞中支原體的流程圖

Mynox®殺除支原體功能強(qiáng)大有效，但由于價(jià)格昂貴，上圖中使用的200ul人民幣要5000元左右，使得應(yīng)用于細(xì)胞保種的數(shù)量受到價(jià)格的限制。

方法三：對(duì)于已耗費(fèi)很多時(shí)間，大量擴(kuò)增起來(lái)的細(xì)胞，或經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染、體外刺激等大量工作處理過的細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染了，怎么辦？此時(shí)由于前期工作量巨大，使操作人員無(wú)法丟棄已有細(xì)胞。

但由于價(jià)格原因，又無(wú)法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細(xì)胞上的支原體，

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員還需要清除細(xì)胞上的支原體污染，讓實(shí)驗(yàn)得以往下推進(jìn)，以終獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

此時(shí)，實(shí)驗(yàn)者可選用對(duì)支原體*的抑制劑，通過對(duì)細(xì)胞的前期處理，中期加藥，逐步通過4代左右的培養(yǎng)，得以將支原體污染*清除，確保試驗(yàn)順利推進(jìn)，結(jié)果準(zhǔn)確。