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支原體常規(guī)檢測方法匯總~之二

更新時間:2021-11-24  |  點(diǎn)擊率:806

上周我們一起討論了基于Venor®Gem qEP試劑盒的支原體qPCR經(jīng)典檢測法,也是目前使用比較廣泛的方法之一。

當(dāng)然啦,關(guān)于支原體的檢測,方法眾多。今天我們就來了解一下,操作相對更簡單的“一步法"。該方法會用到Minerva Biolabs公司的另一種試劑盒——VenorGeM® OneStep,它與上周介紹的經(jīng)典法試劑盒類似,都是利用了熒光定量PCR的基本原理。

(前情提要在這里,戳戳下方圖片傳送到經(jīng)典法支原體檢測試劑盒詳解)

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不同的是,“一步法"試劑盒中,直接將內(nèi)控添加到預(yù)混液中,使用起來更加方便、節(jié)省時間。

下面我們就來詳細(xì)介紹一下VenorGeM® OneStep支原體檢測試劑盒。??

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使用方法

步驟

與經(jīng)典法大致相同:

樣品處理?試劑制備?體系建立?啟動PCR反應(yīng)?結(jié)果判定

樣品處理:

取100μl左右的細(xì)胞上清液

95℃孵育后離心,取適量用于后續(xù)qPCR。

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細(xì)胞培養(yǎng)樣品易含豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩(wěn)定化處理。

試劑制備:

將緩沖液、預(yù)混液、陽性對照等試劑按照說明書要求,該離心的離心、該混合的混合,處理好后扣緊蓋子備用。

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PCR體系建立:

在PCR管中,根據(jù)需要,加入樣品、陽性對照、新鮮培養(yǎng)基(陰性對照),并且設(shè)置好重復(fù)孔,蓋好蓋子,震蕩混勻。

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啟動PCR反應(yīng):

按照所需參數(shù),設(shè)置好PCR儀,啟動程序(具體參數(shù)詳見產(chǎn)品使用說明或是締一生物網(wǎng)站,點(diǎn)擊下方閱讀原文即可)。

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FAM通道:檢測支原體熒光信號。

HEX通道:檢測內(nèi)控對照熒光信號

支原體DNA和內(nèi)控DNA,存在信號之間的競爭性抑制

支原體DNA越多,F(xiàn)AM通道信號越高

檢測內(nèi)控對照的HEX信號通道信號越低。

定量需要基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

Ct<40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。

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小結(jié):

總的來說,一步法試劑盒是經(jīng)典版試劑盒的升級版。

在以下幾個方面都是相同的:

①都具有高特異性:一次即可涵蓋所有常見易感染細(xì)胞的支原體物種(包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體)。與細(xì)菌和真核DNA無交叉反應(yīng)。

②都具有高靈敏度:最高檢測限可達(dá)到10CFU/ml。

③都具有相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA,便于特異性驗(yàn)證。

④都有相應(yīng)配套的支原體絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品,便于最后定量檢測。

不同之處在于,一步法試劑盒省去了配置內(nèi)控對照的環(huán)節(jié),為實(shí)驗(yàn)人員節(jié)省了寶貴時間,但相應(yīng)的,價格也會比經(jīng)典法試劑盒高出一部分。



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