微生物污染是造成細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因 那對(duì)于平時(shí)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，我們?cè)撊绾蜗竞蜏缇兀?br /> 

　　(一)物理消毒法
 

　　1、紫外線消毒:紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌尤為敏感，其次是陽(yáng)性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力強(qiáng)。紫外線的直接作用是通過(guò)破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過(guò)紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡(jiǎn)單，效果好。
 

　　紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強(qiáng)度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強(qiáng)度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時(shí)間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時(shí)間要適合。離地面2米的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2-3小時(shí)，期間可間隔30分鐘。燈管離地面2米以外要延長(zhǎng)照射時(shí)間，2.5米照射效果較差。紫外燈照射工作臺(tái)的距離不應(yīng)超過(guò)1.5米，照射時(shí)間30分鐘為宜。
 

　　紫外燈不僅對(duì)皮膚、眼睛傷害，且對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開(kāi)著紫外等操作。
 

　　2、高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是常用的高溫濕熱滅菌方法。對(duì)生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。
 

　　不同壓力蒸汽所達(dá)到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時(shí)間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品(不包括液體)，應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆?，否則，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡(jiǎn)單、使用方便等特點(diǎn)。
 

　　3、高溫干熱消毒：干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以上，并保持90-120分鐘，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿(如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶)、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品(如粉劑、油劑)。
 

　　干熱滅菌后要關(guān)掉開(kāi)關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開(kāi)，切忌立即打開(kāi)，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。
 

　　燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺(tái)面上的酒精燈的火焰對(duì)金屬器皿及玻璃器皿口緣進(jìn)行燒灼消毒。
 

　　4、過(guò)濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過(guò)濾，使大于孔徑的細(xì)菌等微生物顆粒阻留，從而達(dá)到除菌目的。在體外培養(yǎng)時(shí)，過(guò)濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實(shí)驗(yàn)室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無(wú)菌過(guò)濾過(guò)程。
 

　　(二)化學(xué)消毒：新潔而滅，其0.1%水溶液可對(duì)器械、皮膚、操作表面進(jìn)行擦拭和浸泡消毒。
 

　　(三)抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過(guò)程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。
 

　　可用于細(xì)胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應(yīng)范圍。如常用的過(guò)濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實(shí)驗(yàn)室空氣；多用新潔而滅消毒實(shí)驗(yàn)室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿；采用高壓蒸汽滅菌或過(guò)濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。
 

　　一、環(huán)境中的支原體污染的預(yù)防和清除
 

　　Mycoplasma OffTM是一款支原體噴霧劑，用于清除工作區(qū)域中的支原體。它起效快(10秒鐘即起效)，安全無(wú)毒，對(duì)細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生不良影響，噴灑后，可再用干凈紙張擦拭即可。對(duì)于工作臺(tái)以及各種細(xì)胞操作的器具表面，均可使用。如果是需要避免沾染液體的電子設(shè)備，可使用Mycoplasma OffTM濕巾擦拭。
 

　　細(xì)胞孵箱、水浴鍋等有溫水的地方，也容易滋生支原體、細(xì)菌等。在循環(huán)水中倒入Water ShieldTM(1：200稀釋)即可有效地預(yù)防滋生，效果可持續(xù)1個(gè)月左右。
 

Mycoplasma OffTM對(duì)許多細(xì)菌、病毒也有預(yù)防和殺滅作用。
 

　　二、細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的祛除
 

　　通常來(lái)說(shuō)，被污染的細(xì)胞應(yīng)該丟棄，以避免成為污染源。但對(duì)于珍貴的細(xì)胞，可使用Minerva Biolabs公司的Mynox®或Mynox Gold®。以往別的品牌的支原體清除劑，其實(shí)只是抑制劑，它們抑制支原體的DNA合成和蛋白合成，但無(wú)法殺除。Mynox®是市面上一款具有殺滅作用的清除劑。它提取自枯草桿菌，可與支原體膜特異性結(jié)合，破壞膜通透性，導(dǎo)致支原體膨脹破裂而死。使用Mynox®一般在2-3個(gè)小時(shí)即可完成清除任務(wù)。
 

　　Mynox Gold®是Mynox®的升級(jí)版，它通過(guò)四個(gè)療程產(chǎn)生作用。每個(gè)療程即細(xì)胞傳一代。它除了包括Mynox®，也包含復(fù)合抗生素成分。以往別的品牌的支原體清除劑只是針對(duì)支原體的抗生素成分，但也容易產(chǎn)生耐藥。Mynox Gold®將Mynox®和抗生素結(jié)合，即結(jié)合了二者的優(yōu)點(diǎn)，又去除了二者的不足，因?yàn)橛械募?xì)胞對(duì)Mynox®的治療不太適應(yīng)，而Mynox Gold®要比Mynox®更加溫和，對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)極小，因而更適用于脆弱的不太好養(yǎng)的細(xì)胞。
 

　　三、細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的預(yù)防
 

　　Zell ShieldTM直譯過(guò)來(lái)是細(xì)胞盾pai，它不僅能殺菌，還可抑制支原體的蛋白和DNA合成，因而能避免支原體的污染。使用時(shí)按1：100的比例加到培養(yǎng)基中，即可使用。它是復(fù)合抗生素成分，支原體耐藥的出現(xiàn)幾率很低。
 

四、細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的監(jiān)測(cè)
 

　　可使用MB公司出品的Venor® Gem系列，常用的是一步法試劑盒(Venor® Gem OneStep)，它采用靈敏的PCR方法，能識(shí)別常見(jiàn)的至少二十七種支原體。所有試劑均在一管內(nèi)，為穩(wěn)定的凍干粉形式，用緩沖液溶解后可直接使用。細(xì)胞上清取2l即可完成支原體的篩查。
 

　　總之，支原體雖然發(fā)生率高，但可放可控。以上僅僅列舉的是實(shí)驗(yàn)室的情況，對(duì)于生物制藥企業(yè)，如果是病毒液中發(fā)現(xiàn)支原體的污染，也可以采用Mynox®進(jìn)行清除。總之，支原體的檢測(cè)和預(yù)防已成為一項(xiàng)常規(guī)操作，這對(duì)保障細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，是非常重要的。