- 優(yōu)質(zhì)血清助力細胞學實驗 -
上期內(nèi)容里,我們介紹了細胞轉(zhuǎn)染的基本基本知識,包括概念、應(yīng)用場景以及各種方法之間的優(yōu)劣對比。
本期內(nèi)容,進一步為大家介紹常用的細胞轉(zhuǎn)染方法——實操篇。
- 細胞轉(zhuǎn)染常用方法 -
陽離子脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染
原理:陽離子脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染是目前常用的轉(zhuǎn)染方式之一。
陽離子脂質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)由帶正電荷的頭基和一個或兩個烴鏈組成。
帶正電荷的頭基與帶負電荷的核酸通過靜電作用形成復合物。
經(jīng)細胞的內(nèi)吞作用進入細胞。
實驗過程:將DNA,RNA,siRNA或寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細胞中,脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復合物粘附到細胞膜上→復合物經(jīng)細胞內(nèi)吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。
磷酸鈣共沉淀
原理:將DNA與氯化鈣在磷酸緩沖鹽水中混合形成磷酸鈣-DNA沉淀物,然后將其分散在培養(yǎng)的細胞上,磷酸鈣促進共沉淀物中的縮合DNA與細胞表面的結(jié)合,DNA通過內(nèi)吞作用進入細胞。
實驗過程:將氯化鈣和DNA混合,以可控的方式加入磷酸緩沖液→在室溫下孵育,以形成極細,可溶的共沉淀微粒→將磷酸鈣-DNA沉淀物加入細胞中,后者能黏附到細胞膜表面→共沉淀物經(jīng)細胞內(nèi)吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。
病毒轉(zhuǎn)染
原理:對于用脂質(zhì)體不能實現(xiàn)轉(zhuǎn)染的細胞,可以采用病毒轉(zhuǎn)染。腺病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動物細胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染。
實驗過程:通過基因克隆方法獲得重組病毒表達載體→轉(zhuǎn)染包裝細胞系,擴增并分離得到重組病毒顆粒→純化并滴定病毒液→轉(zhuǎn)導目的細胞(含病毒特異性的受體)→從培養(yǎng)基中移除病毒→檢測基因表達或沉默情況。
電轉(zhuǎn)
原理:利用電脈沖在細胞膜上形成暫時的孔使核酸物質(zhì)能穿過孔進入細胞。
實驗過程:利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細胞→對含有核酸,緩沖液,細胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細胞膜上形成電勢差,誘導產(chǎn)生暫時的孔使核酸進入細胞→將細胞返回到生長培養(yǎng)基中,使其慢慢恢復→檢測基因表達或沉默情況。
血清在細胞培養(yǎng)過程中的重要性不言而喻:
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提供對維持細胞指數(shù)生長的激素,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物,以及主要的低分子營養(yǎng)物。
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提供結(jié)合蛋白,能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等,能結(jié)合或調(diào)節(jié)它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。
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有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合,起到解毒作用。
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是細胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源。
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起酸堿度緩沖液作用。
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提供蛋白酶抑制劑,使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活,保護細胞不受傷害。
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參與細胞凍存。
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