細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染是經(jīng)常發(fā)生的。在細(xì)胞培養(yǎng)物中消除、滅活或抑制支原體常用的方法是用抗生素處理。

然而，一般來(lái)說(shuō)，單靠抗生素處理不能長(zhǎng)久地消除支原體。此外，抗生素的細(xì)胞毒性可在真核細(xì)胞中引起不良反應(yīng)，并可能促進(jìn)耐藥支原體菌株的發(fā)展。因此推薦使用，針對(duì)支原體起作用的支原體清除試劑——Mynox®  Gold。

產(chǎn)品名稱：珍貴細(xì)胞株 清除支原體試劑

英文：Mynox® Gold Mycoplasma Elimination Reagent

品牌：Minerva-Biolabs®    

貨號(hào)：10-0201

規(guī)格：2套/盒    

Mynox® Gold代表了經(jīng)典Mynox®試劑的進(jìn)一步發(fā)展，將抗生素和生物試劑與生物物理作用模式相結(jié)合，從而盡可能殺滅細(xì)胞中的支原體。

與其他細(xì)菌細(xì)胞相比，支原體沒有細(xì)胞壁，但被質(zhì)膜包圍。Mynox® Gold中含有的生物試劑可整合到支原體膜中，并損害其完整性。由于這種聯(lián)合配方，生物試劑和抗生素的有效劑量可以降低到更低的細(xì)胞毒性，同時(shí)仍然可靠和明確地消除支原體。

該試劑的生物物理作用模式將耐藥菌株的發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)降至可忽略不計(jì)的水平。

Mynox® Gold的一次應(yīng)用包括4個(gè)小瓶：1個(gè)『治療液』和2個(gè)『鞏固液』，每種成分都是無(wú)菌的即用型溶液。『治療液』破壞大部分支原體顆粒，而『鞏固液』不可逆轉(zhuǎn)地破壞所有剩余顆粒，將支原體從處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)物中消除。兩種處理方法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞都是無(wú)害的。

以下方法步驟是為需要標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的典型細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，可用于貼壁和懸浮細(xì)胞系，個(gè)別情況下可能需要對(duì)這些程序進(jìn)行修改和優(yōu)化。

一、『治療液』混合物的制備

1.將4.5 ml含5% v/v FCS的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基移入15ml無(wú)菌錐形離心管中，并加入500µl Mynox®Gold Starter Treatment(橙紅色蓋的小瓶)。

2.旋渦Mynox® Gold/培養(yǎng)基混合物。

3.將Mynox® Gold培養(yǎng)基混合物(5ml)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌25平方厘米細(xì)胞培養(yǎng)瓶或無(wú)菌6cm培養(yǎng)皿中。

二、制備細(xì)胞

1.像往常一樣傳代細(xì)胞，用胰蛋白酶分離細(xì)胞團(tuán)，獲得單個(gè)細(xì)胞。

2.將含有5% (v/v) FCS的5ml細(xì)胞培養(yǎng)基中的10^4 - 10^5個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Mynox®Gold培養(yǎng)基混合物中。處理混合物的總?cè)莘e為10 ml，最終FCS濃度為5% (v/v)。

3.輕輕地前后左右搖動(dòng)燒瓶或培養(yǎng)皿，以避免細(xì)胞分布不均勻。像往常一樣孵育細(xì)胞，然后進(jìn)行Mynox® Gold鞏固處理。

三、鞏固處理

1.培養(yǎng)細(xì)胞至80 - 90%的融合度。

2.以常規(guī)方式傳代。向含新鮮培養(yǎng)基的9.5 ml傳代細(xì)胞中，加入500µl Mynox®Gold『鞏固液』試劑(白色透明帽的小瓶)。調(diào)整FCS濃度。不再需要添加5% (v/v)的FCS。

3.重復(fù)Mynox® Gold鞏固處理2次以上。在第3次治療后(從起始處理開始共4代)，支原體消除程序完成。

四、支原體檢測(cè)

1. Mynox® gold處理的細(xì)胞培養(yǎng)物和病毒庫(kù)需要在不含支原體抗生素的情況下再培養(yǎng)4代，然后才能檢測(cè)支原體是否再次出現(xiàn)。對(duì)于高靈敏度的支原體污染檢測(cè)，我們推薦使用基于PCR的Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒

2.  定期重復(fù)PCR支原體檢測(cè)試驗(yàn)，以確保維持無(wú)支原體的細(xì)胞培養(yǎng)。

??由于Mynox®Gold的作用模式是基于其與支原體膜的物理絡(luò)合作用，因此有效的治療需要試劑與支原體顆粒直接接觸。應(yīng)避免治療細(xì)胞團(tuán)。支原體可以積聚在細(xì)胞間隙以及細(xì)胞膜的口袋和縫隙中，從而逃避與藥物的接觸。在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化處理時(shí)，需要在顯微鏡下檢查，確保對(duì)單個(gè)細(xì)胞的處理。如有必要，增加胰蛋白酶處理的持續(xù)時(shí)間或通過(guò)仔細(xì)上下移液機(jī)械分解細(xì)胞團(tuán)。

??用于處理的細(xì)胞總數(shù)不應(yīng)超過(guò)10^5個(gè)細(xì)胞(每個(gè)25平方厘米的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或6厘米的培養(yǎng)皿)。這保證了低支原體負(fù)荷。

??向『治療液』中添加細(xì)胞時(shí)，應(yīng)將移液管直接插入治療混合物中，以避免氣溶膠。注意不要用吸管頭接觸燒瓶?jī)?nèi)壁或培養(yǎng)皿內(nèi)壁。

??支原體去除處理后，不應(yīng)直接使用基于PCR的檢測(cè)方法。Mynox® Gold溶解支原體顆粒，隨后將支原體DNA釋放到培養(yǎng)基中。然后可以通過(guò)PCR檢測(cè)到游離DNA，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

??Mynox® Gold的效果，受反應(yīng)混合物中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)濃度的影響，例如，培養(yǎng)基補(bǔ)充劑的成分，如胎牛血清(FCS)。這些成分競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合Mynox® Gold中所含的生物試劑，并防止其與支原體膜結(jié)合。因此，我們建議，在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用5% v/v FCS進(jìn)行。由于血清蛋白和脂質(zhì)成分的抑制作用，目前還沒有針對(duì)高蛋白和脂質(zhì)濃度生物制劑的治療方案。

??細(xì)胞培養(yǎng)基的類型不影響處理的效率。抗生素，特別是在需要選擇的情況下，可以在治療混合物中使用。